Treg抑制实验

材料

PBMC

Treg细胞

Anti-CD3

CFSE

PBMC培养基

Anti-CD8（荧光素标记或其余可用于FACs检测的标记）

步骤

1.按照我们的标准程序解冻PBMC，并用CFSE标记细胞（见CFSE标记实验protocol）

2.解冻Treg细胞，调节细胞浓度至10⁶/ml

3.将Treg细胞以100uL/孔加入到96孔板

4.将CFSE标记的PBMC调整至5 x 106 /ml，并在96孔板上每孔添加50 ul。

5.将anti-CD3稀释至4 ug/ml，并在96孔板的每孔中添加50 ul；

6.在37°C，6%的二氧化碳下培养4-5天。

7.收集细胞，用Anti-CD8染色。

8.对CD8+细胞群进行流式细胞仪门控分析。

注意点

1.    对照措施应包括：未添加抗CD3或Tregs的单独的CFSE标记的PBMC，以及添加AntiCD3的CFSE的标记PBMC，但没有Tregs。

2.    没有anti-CD3的PBMC不会增殖，但会提供未增殖细胞的荧光测量背景。

3.    具有抗CD3的PBMC将具有离散的荧光强度峰值，标记每一次细胞分裂。在没有添加Tregs的PBMC中，可以很容易地看到其中的五到六个峰值。当更多的Tregs与PBMC一起培养时，峰值数量减少，更多的细胞保持在未分化状态；

4.    对于小鼠Tregs，使用脾脏细胞而不是PBMC。小鼠脾脏中T细胞的比例低于PBMC中T细胞的比例。将每孔脾脏细胞数增加到500000个，以确保足够的CD8+细胞用于分析。可能还需要增加Treg数量。