PBMC细胞复苏protocol

StemExpress细胞冷冻液中含DMSO（10%），用程控降温方式进行冷冻。请使用以下方法对细胞进行复苏以最大程度保证细胞活性。

材料

冷冻细胞

RPMI+10%FBS或加热至37度的培养基

buffer：PBS，0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mm EDTA

50ml无菌离心管

70%乙醇

设备

水浴加热到37度C

离心机

5毫升吸管

移液管和移液管头

步骤

1.    将含10% FBS的RPMI放入37℃水浴中；

2.    将冻存管置于37度水浴中约1.5min，并不断旋转，但不要淹没整个冻存管；

注意：从液氮罐中取出冻存管后应立即执行此步骤

3.    当小冰晶仍有残留时取出冷冻瓶；

注意：在水浴中过长时间会损坏细胞和增加细胞死亡

4.    放入生物安全柜中，用70%乙醇擦拭冻存管外部；

5.    使用5毫升移液管将冻存管中的内容物转移到50 ml锥形管中；

6.    用1ml含有10%FBS的热RPMI冲洗冷冻小瓶，然后转移到50 ml锥形管；

注意：冲洗冻存管有助于回收粘附在管壁的细胞；

7.    为了去除细胞冷冻的DMSO，添加15毫升含有10%FBS的热RPMI，并离心6分钟—804 rcf（accel 9, brake 9）；

8.    去除上清液，轻轻地将细胞重新悬浮在2毫升热缓冲液中；

注意：不要使用涡流混合器之类的重新悬浮细胞，这将破坏细胞，降低活性

9.    随后进行细胞计数