一文解读PBMC：药物研发的最佳搭档

2019-05-27 10:31 严国樑

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Origin of Peripheral Blood Mononuclear Cells

外周血单个核细胞（PBMC）来源于骨髓中的造血干细胞
(HSC)。HSC通过造血过程产生免疫系统的所有血细胞。HSC可以分化成两个谱系：髓系
(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、树突状细胞、红细胞) 和淋巴系
(T 细胞、B 细胞、NK 细胞) (如图1，2)。

PBMC是具有圆形细胞核的血液细胞, 在上述两个谱系中都有构成PBMC的相关细胞，是由不同构成比例的淋巴细胞 (T细胞、B细胞和NK细胞)、树突状细胞和单核细胞组成的细胞群 (表1)。这些细胞是先天免疫和适应性免疫系统的关键组成部分, 可以保护身体免受病毒、细菌和寄生虫的感染和异物侵扰, 并且能够消灭肿瘤细胞。

Table 1.
Average cell frequencies from enriched PBMC fractions.

The Frequency of Different Cell Populations within the PBMC Fraction

PBMC中不同亚型比例因人而异，但平均而言,淋巴细胞占PBMC的大多数(70%-90%)。淋巴细胞在细胞介导和体液免疫反应中起着至关重要的作用, 主要与T和B细胞的激活有关。在淋巴细胞群体中,CD3+T细胞占了整个PBMC的
45-70%。大多数 T 细胞以未被抗原激活的naive
T细胞或memory T细胞的状态存在。因而在健康的捐献者中，已被抗原激活的T细胞仅占很小一部分。一旦T细胞被激活就会启动细胞介导的免疫反应。

同样, 健康捐献者中CD19+ B 细胞主要以naive或memory
B细胞的状态存在，等待抗原激活, 其仅占淋巴细胞总数的5-15%。一旦B细胞被激活，其可以分化为能大量分泌抗体的浆细胞, 这些抗体专门针对血液中循环的游离抗原，引发体液免疫反应。

NK 细胞在淋巴细胞群中所占比例较小 (5-10%)。NK细胞常被认为是先天免疫系统的一部分, 是属于我们身体的第二道防御系统（第一道是由皮肤和粘膜组成的物理防线，第三道就是适应性免疫）。这些细胞在不需要抗原的情况下执行其效应功能, 并保护身体免受肿瘤活动的影响。

一小部分细胞包括树突状细胞 (1-2%)在先天免疫系统和适应性免疫系统之间构成重要的桥梁。树突状细胞是一种高度专业化的抗原呈现细胞（APC）, 它吞没抗原并将抗原片段呈现给自适应免疫系统的细胞（人HLA（MHC）分型类别及分型方法介绍，抗原介绍--从六个方面完整阐述抗原）, 从而激活 T 细胞和 B 细胞。

与淋巴细胞不同，在收到刺激信号后，在血液循环中游荡的单核细胞
(10-30%) 需要动员到组织中，并在那里成熟并分化为树突状细胞或巨噬细胞, 从而起到抗原提呈或细胞吞噬功能，调节先天和适应性免疫反应。

最后, 但非常重要的是造血干细胞。血液和骨髓中的HSC产生血液中的所有细胞, 包括红血球、血小板、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。虽然这种罕见的细胞群只占 PBMC 总量的 0.1-0.2%, 这使得它们很难以从全血样本中分离出来。但通过注射动员剂, 如粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 或 Plerixa, 可以将 CD34+ 干细胞的比例增加到 0.5-1.5%。

Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells

提取外周血单个核细胞主要有两种方式：

1.　获取全血随后通过密度梯度离心（Ficoll）。常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的Ficoll液密度为　1.077±0.001 g/ml，红细胞、粒细胞由于密度较大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的密度小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分离液的液面上。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。见Figure 3：

Figure 3. Whole blood layered onto a density gradient medium. After centrifugation, the PBMC fraction is defined by the white layer at the interface between the plasma and the density gradient medium.

2.　用单采机直接采集单个核成分血（一次提取10000000000的PBMC.......把人抽干的节奏？？？！！！）：单采机是一种自动化设备, 它使用高速离心将PBMC直接分离, 同时将血浆、红血球和粒细胞等回输给捐献者，从而确保了采集过程中献血员血容量始终保持平衡，对其心血管系统影响小，更为安全。平均而言, 通过单采得到的PBMC比全血密度梯度离心过程多14倍（见Figure 4），且捐献者可间隔30天重复捐献，一年最多可捐献12次，这使其成为大规模研究或临床前试验的理想选择。客户可以根据实际实验, 进一步离心以去除残留的红血球 (RBC裂解) 和粒细胞 (密度梯度离心)。

Figure 4. PBMCs were collected from 8 different donors per collection group (Leukopak^®
and Whole Blood) and counted using a hemocytometer to determine cell yield.

Peripheral Blood Mononuclear Cells in Research

PBMC是免疫系统的关键组成部分,因此在免疫学、传染病、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗、个性化医学和毒理学等领域作为最基础的实验原料被广泛使用。

如现在大家在肿瘤免疫药物研发中常见的体外实验（免疫检查点药物研发--PBMC相关体外实验）：MLR, SEB，ADCC（抗体依赖细胞毒作用（ADCC)）, T细胞激活或抑制，CMV Recall， Treg抑制等（见下图）和PBMC构建的人源化小鼠（常见的免疫系统人源化小鼠模型介绍）

同时基于PBMC的研究也正在扩展到精准医学。从单供者的PBMC中诱导得到的多能干细胞 (iPSc) 对疾病建模、药物毒性筛查、药物发现和细胞替代疗法的个性化医学具有重要意义。使用基因组编辑技术, 如 CRISPR/Cas9, 可以将免疫细胞 (如来自PBMC的T细胞) 转化为通用型CAR-T 细胞, 从而能够在没有供体匹配的情况下治疗癌症。

How to Choose the Fresh or Frozen PBMC

新鲜PBMC相对于冷冻PBMC而言，确实有其优势：

1.　细胞冷冻复苏难免会对其活性造成影响，死亡的细胞及碎片可以靠离心去除，但复苏后状态较差的细胞会影响自身及周边细胞的功能，因而对实验造成干扰；

2.　由于PBMC中含有一些含量非常低的细胞（如CD34+），冷冻复苏会对这类本身含量就很稀缺的细胞造成较大影响；

不过现阶段由于国内法律禁止任何的血液买卖和绕开血站或医院私下有偿采集血液（黑金——血液买卖——艾滋村），因而样本来源困难，抑或来源完全不合规且供应商对来源渠道均讳莫如深，这就容易导致以下的问题：

1. PBMC质量及服务的良莠不齐。样本源头就很难保证，何谈确保PBMC的质量稳定性，同时供应时间常常不稳定，实验需要跟着供应时间走；

2.　更加严重的是由于血液本身为敏感传染源，基于来源的不透明不稳定，很难确保病毒检测的百分百可靠性，这也给实际操作人员带来巨大的实验风险；

3.　产品无法溯源，无法提供可用于申报的合规的伦理、知情，留下后患；

4.　同时很多所谓的新鲜产品事实上已经不是真正的Fresh：经过实验发现，对于PBMC而言，离体之后越快冷冻越能保证其活性及功能。当采购PBMC时，使用当天分离并即刻冷冻的PBMC对实验更为理想。当从静置24h后的Leukopak（模拟运输环境）中分离得到的PBMC，其组分中T细胞和NK细胞含量会发生明显变化，同时对刺激反应弱化。如果是从全血中提取PBMC，当全血离体一段时间后，再使用Ficoll进行分离，最终得到的细胞层中中性粒细胞含量会明显增高，根据文献报道，这是因为中性粒细胞离体后会被活化，而这会影响中性粒细胞的密度，因而会严重影响密度梯度离心得到PBMC的效率（How Fresh Are Your PBMC?）。

从现阶段大量客户的反馈来看，对上文中提到的所有实验，使用冷冻PBMC是完全可行的方案，且冷冻PBMC优势较为明显:

1. StemExpress国外原装进口的冷冻产品均有伦理及知情，免除后顾之忧；

2.　每个donor均进行完善的病毒检测，真正做到了用的放心；

3.　细胞复苏活性可以保证，一般复苏活性＞90%；

4. 可根据实验需要挑选特殊个体（人种，性别，HLA-typing，CMV情况等）；

5. 减少个体差异，保证实验的连续稳定，单一donor一次捐献可以提取50管100million产品，且可间隔30天重复抽取；

6.　冷冻细胞液氮保存即可，随用随取，可任意安排实验时间；

7.　提供磁珠分选好的亚型细胞，特别是对于Treg这类含量很少的细胞，由于国外能够得到的PBMC量巨大，因而可以得到的单个个体来源的稀缺细胞数量亦较大；

Conclusion

PBMC是与人类健康和疾病有关的研究和临床研究的有力工具。通过对PBMC的研究, 研究人员和临床医生可以测试免疫反应, 更深入地了解免疫系统, 并将发现应用于人类疾病的治疗。

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No Worry For Your Cell Again！

参考：

1.StemExpress：https://www.stemexpress.com/blogs/peripheral-blood-mononuclear-cells/

2.Wang, C., et al. (2014). "In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo toxicology in Non-Human Primates."
2(9): 846-856.

3.Maximizing PMBC Recovery and Viability: A Method to Optimize andStreamline Peripheral Blood Mononuclear Cell Isolation,Cryopreservation,and Thawing: www.bioprocessintl.com/manufacturing/cell-therapies

4.McKenna KC, et al. Delayed Processing of Blood Increases theFrequency of Activated CD11b+ CD15+ Granulocytes Which Inhibit T Cell Function.J. Immunol. Meth. 341, 2009: 68–75.

5.DeRose R. Granulocyte ContaminationDramatically Inhibits Spot Formation in AIDS Virus–Specific ELISpot Assays:Analysis and Strategies to Ameliorate. J. Immunol. Meth. 297, 2005:177–186.

6.How Fresh Are Your PBMC by Astrobio

后续小编准备围绕我们的PBMC，一次介绍一种细胞（如DC, Treg， CD8， CD4，NK等），感兴趣的可以关注我司公众号

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