PBMC质检标准大改革

冷冻PBMC相对于新鲜PBMC由于具有随用随取和同批次数量多的优势，在实际实验过程中，大家也用的越来越频繁。但在使用过程中，我们也经常听到反馈，主要集中在两块：

1. 细胞刚复苏时候的活性非常好，但有时候养到第二天活性比较差？
   

2. 我明明用的是同一个批次，但结果还是飘忽不定？

其中问题1肯定是冻存导致的问题，问题2是分装工艺的问题。我们实验室针对这两个问题也做了很多探索。

一、细胞冷冻导致的延发性细胞死亡

关于这块其实有比较多的文献报道，也有专门的术语（CIDOCD）.

Often cells appear healthy and viable when examined immediately after thawing; however when examined 24–48 h later, a signifi cant portion (30–70 %) of these cells are lost due to cryopreservation-induced delayed-onset cell death (CIDOCD) This phenomenon has been reported in many cell systems and demonstrates that while the cryopreservation process may be optimized to protect cells structurally, it
fails to adequately manage the other stresses associated with this process.

1. 对冻存的PBMC而言，我们建议以过夜后的活性作为质检标准，而不是以刚复苏的作为质检标准。其次
   

2. AO/PI作为最常用的检测PBMC活性的方式是由于可以排除红细胞的影响。其中AO可以通过完整的细胞膜，呈现绿色荧光；PI只能通过死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。但使用细胞计数仪无法排除当细胞冷冻复苏后，由于冻存时候小冰晶的影响，可能导致细胞膜上面有穿孔，但又不至于导致细胞死亡的情况。但实际上，这种细胞在后续实验过程中效果会非常差。因而我们建议在质检中加入复苏第二天的LDH检测。
   

二、同批次之间的管间差

现阶段分离PBMC的原料一般是Leukopak，关于Leukopak与全血的分离的区别如下：

这样会导致一个问题，每次分装的细胞管数量过多，然后冻存液是非常粘性的，没有办法在分装中不停的去吹打混匀，这必然导致在分装过程中出现很明显的管间差，可以这么讲，第一管和最后一管基本上不论是细胞数量还是细胞组成其实都会有很大区别，这也是大家在使用过程中经常碰到的为什么我明明用的是同一个批次同一个规格，但重复出来的结果却有很大差异。我司经过反复的摸索，现阶段终于有效的解决了此问题，如下：

1. Baust, J. M., et al. (2001). "A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation to improve cell survival." Cell Transplant 10(7): 561-571.

2. Book_Biobanking And Cryopreservation.

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