自然杀伤（NK）细胞的生物特征、来源及扩增情况介绍

2023-10-09 12:21 严国樑

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现阶段自体CAR-T存在以下问题：1. 高成本导致用不起；2. 生产周期较长导致病人等不起；3. 病人样本细胞质量差可能导致生产失败；4. CRS和神经毒性导致治疗风险高。针对前3点，通用CAR是一个非常好的解决方案，但通用CAR-T由于要去除GvHD效应因而必然要引入额外的基因编辑步骤以去除TCR，这就引入了很多新的问题。在这样的背景下，NK细胞由于其特殊的生物特征就显示出了其作为潜在的Off-the-shelf通用CAR-NK的独特优势。NK细胞的生物特征NK细胞与T细胞和NKT最大的区别就是不表达TCR和CD3复合体，可以根据CD16和CD56的表达情况分为两类：通过因子释放实现免疫调节的CD56bright CD16low/–（类似于CD4+ T）和杀伤为主的CD56dimCD16+（类似于CD8+ T细胞）。因而NK细胞的作用机理就比较清楚了，NK cells possess strong cytotoxicity and, upon forming immunological synapses with targets, elicit a potent response through the release of cytolytic granules and cytotoxic cytokines. Moreover, they can recognize antibody-coated cells through their FcγRIIIA (CD16) receptor and trigger antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and cytokine production. NK cells have also been described as ‘immune-regulatory’ because of their ability to produce an array of cytokines and chemokines, through which they help shape B cell and T cell responses, and impact the function of dendritic cells, macrophages and neutrophils.但NK细胞作为肿瘤治疗武器的临床应用存在一些局限性：(1)NK只占外周血白细胞的一小部分，需要大量的NK细胞才能达到临床疗效；(2)NK细胞需要被充分激活才能诱导肿瘤细胞的杀伤。经过研究发现NK细胞与一般的先天免疫细胞不同，其具有潜在的记忆功能，这就意味着我们可以使用类似于抗原回忆反应的机理去激活NK细胞并使其进行扩增，根据Todd等人的研究表明，使用IL12, IL15和IL18预激活的NK细胞，1-3周后可使用相应的细胞因子或K562细胞进行重激活并释放IFN-γ。这就为解决NK细胞的局限性提供了很好的解决方案。NK的来源及扩增NK可以来自以下4个来源，包括外周血单个核细胞(PBMCs)、脐带血(UCB)、诱导多能干细胞(iPSCs)和NK细胞系。

图1. 不同来源的NK细胞1)
原代PB-NK细胞：外周血淋巴细胞中只有5%-15%的细胞是NK细胞，因此，从外周血中大量分离NK细胞是有难度的。同时，细胞冻存会导致PB-NK细胞产量降低和细胞毒性的损失（通过加入细胞因子和feeder可以部分解决该问题），这也增加了NK细胞的应用困难。常见的培养方式及优劣势如下

图2. 扩增PBMC来源的NK细胞的一些方法

细胞因子是维持NK细胞存活和支持NK细胞体外增殖的关键成分，而不需要滋养细胞。然而，当使用不同的细胞因子和培养条件时，发现具有不同的扩增效率。单独使用IL-15或IL-2等细胞因子对NK细胞的扩增相对温和。在含有0.5%人AB血清和2813 IU/ml IL-2的KBM-501培养液中，NK细胞在14天内扩增效率约为200倍。除了使用细胞因子的策略外，还探索了其他选择，包括照射的肿瘤细胞、同种异体PBMCs和淋巴母细胞衍生物作为饲养细胞来促进体外NK细胞的扩增。缺乏人类白细胞抗原表达的K562细胞通过激活共刺激信号促进NK细胞的增殖。据报道，当K562细胞作为饲养细胞与IL-2和IL-15联合使用时，NK细胞的扩增超过300倍。此外，肿瘤细胞膜颗粒也是肿瘤细胞系扩增NK细胞的有效替代品，其不仅保持了诱导NK细胞扩增的膜受体的激活效率，而且避免了肿瘤细胞与扩增产物混合的风险。

2)原代CB-NK细胞：虽然脐带血中NK细胞的比例稍高，但是单位脐带血NK细胞的数量却不多。与PB-NK细胞相比，CB-NK细胞杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和颗粒酶B的表达较低，而NKG2A抑制受体的表达较高，提示CB-NK细胞表型不成熟，具有较小的细胞杀伤毒性；体外扩增的UCB-NK细胞在某些条件下的细胞毒性与PB-NK细胞相似。细胞因子如IL-2、IL-5和IL-21的单一或简单组合已被用于扩增UCB-NK细胞。然而，由于这些条件下的有限扩张，新的无饲养层扩张系统正在开发中。IL-2、链球菌和唑来膦酸盐刺激脐血单个核细胞3周，可产生平均纯度为95%的NK细胞，扩增倍数为1561倍。这种无饲养层的方法降低了将其他类型的细胞引入最终产品的风险，但NK细胞的纯度仍需提高。

3)永生化NK细胞系：目前已经建立的NK细胞系包括NK-92、YT、NKL、HANK-1、KHYG-1、NK-YS、NKG和NK101等8个，其中NK-92是FDA批准用于1期和2期临床试验的唯一细胞系。NK-92来源于快速进展的50岁男性非霍奇金淋巴瘤患者的血液，可以很容易地在体外培养，并通过添加重组IL-2，可以在良好生产规范(GMP)条件下大量扩增，同时可以低温冻存，且解冻后恢复和功能良好。NK-92细胞缺乏大部分KIRs，但表达几种激活受体，适合抗肿瘤治疗。然而，NK-92细胞的一个缺点是不表达低亲和力的Fcγ CD16受体，无法进行ADCC应答；此外，由于该细胞系来源于肿瘤患者，这要求NK-92细胞在过继转移到患者体内之前，需要经过辐射，这也抑制了其在体内的增殖能力和持续时间；

4) iPSC-NK细胞：通过诱导多能干细胞获得的NK细胞，主要有以下几个优点：ꔷ来源途径多（例如从纤维母细胞或外周血获得），可长期储存，在增殖过程中可以保持多能性，而且与原代NK细胞和NK-92细胞具有同样效力；ꔷ输入患者体内前不需要经过辐射；ꔷ表达CD16受体，可以诱导产生ADCC。然而，尚不完全清楚iPSC-NK细胞是否需要同样的激活途径，来诱导颗粒和细胞因子的分泌。未来需要从机制上研究iPSC-NK刺激激活的信号通路。