揭秘补体实验：守护健康的神秘力量

药物的作用机理一般就是自身发挥作用，或以自身做为媒介，引导其它的起作用，现在的抗体药物也无出其右。当然，由于现在的抗体改造方法的不断出现，很多抗体将这两者综合起来。常见的抗体可以分为：

1. 中和/阻断: 占据位点，不让它和别的分子结合。最常见的Check Point药物就属于阻断，新冠期间大火的新冠中和抗体就属于中和。

2. 信号传递/程序性死亡: 激活受体分子，引起下游信号传导；或引起抗原交联，或激活死亡受体，从而最终导致细胞自杀。

从上面的分类其实就能够看出，针对中和/阻断抗体而言，其作用途径不依赖于介导，因而其Fc段常用IgG4，如很多PD-1基本都采用IgG4。针对第二种抗体的分子，不论是否以Fc段的免疫学功能为主，其功能的增强对于抗体发挥作用总是一个锦上添花的事情，因而其Fc段绝大部分采用IgG1，而且为了增强其Fc段的免疫功能，时不时会引入各种突变。

抗体的免疫功能涉及三个常规功能：ADCC/ADCP/CDC，这次我们先来看看CDC。

一、补体介绍

补体系统是免疫系统重要的组成部分，可增强（补充）抗体和吞噬细胞清除微生物和受损细胞、促进炎症和攻击病原体细胞膜的能力，是先天性免疫和获得性免疫的重要参与者。

“补体”这一名称源于比利时免疫学家Jules。他发现，含有抗菌抗体的新鲜血清在37°C下可以溶解细菌，然而，如果血清被加热到56°C或更高温度，它会失去溶解能力。因为抗体结构有热稳定，这种溶解能力的丧失不是抗体活性的衰减引起的（所以补体血清严禁热灭活）。Jules认为血清中含有另一热敏感成分，并命名为“补体”。

补体系统由大约 50种蛋白质和蛋白片段组成，包括血清蛋白和细胞膜受体，它们约占血清中球蛋白的10%。这些蛋白由肝脏合成，当被几种触发因素刺激时，系统中的蛋白酶会切割特定的蛋白质并启动进一步酶切的扩增级联反应，最终可以刺激吞噬细胞清除入侵微生物，诱发炎症以吸引更多的吞噬细胞参与免疫反应，同时可以形成细胞膜攻击复合物，直接对入侵微生物进行杀伤。

图1：补体系统的蛋白组成及对应的生物学功能

在体液系统中，补体蛋白是不活跃或短暂活跃（几秒钟）的，但它们在附着到微生物、抗体或凋亡细胞后或被激活。因此，补体的激活及生物学功能被限制在微生物细胞表面或抗体结合到抗原的部位，而非在血液中发生。

二、依赖补体的杀伤(CDC)作用机制

补体的活化主要有三类机理，分别是旁路途径，甘露糖结合凝集素途径和经典途径，如下图所示：

图2：依赖补体的杀伤(CDC)作用机制

上述三条途径产生的C5转化酶，均可裂解C5，引发共同终末效应，进而发挥其吞噬、裂解细胞、介导炎症反应、调节免疫应答和清除免疫复合物等多种生物学效应。除了发挥积极保护作用，研究发现补体系统一旦失衡或过度激活便会导致多种疾病，如眼部疾病、牙周疾病等急性炎症，自身免疫系统疾病、肿瘤、肾脏疾病、慢性溶血性疾病和神经退行性疾病等。

抗体药物研发比较关注的自然是抗体依赖的经典途径。当IgG抗体的Fab部分结合到这些抗原后，如果满足了一定的条件，这些IgG分子的Fc区域会相互作用、联结。当六个结合了抗原的IgG分子在细胞表面联结成一个环形的六聚体后，这种美丽的“雪花”就成为该细胞的死亡之戳。IgG的Fc上暴露出能结合C1q的位点。C1q是补体系统的第一个蛋白成员，它有六只长臂(gC1q)，分别抓住六个Fc区，并同时携带着一对C1r和一对C1s蛋白酶（C1r2s2）。C1r和C1s开始引发一系列级联反应，其涉及的补体家族成员包括C4,C2,C3,C5,C6,C7,C8和C9。C5b、C6-C9再组装成膜攻击复合体（MAC）。最后MAC会在细胞膜上凿孔，引起细胞裂解。

三、影响CDC作用因素

清楚地知道影响CDC作用的因素，能够使我们更好的开发实验，目前明确知道以下五点:

1)抗体亚型。通常来说，IgG3的CDC作用最大，其次是IgG1，IgG2和IgG4极其微弱。利用基因工程在抗体铰链区或恒定区CH2进行氨基酸替换可以增强或减弱CDC作用。

2)靶细胞抗原的表达水平。过表达抗原的细胞系需要表达足够的抗原来结合抗体和激活补体。抗原表达不足，不能完全激活补体。

3)靶细胞表面表达其他蛋白。在靶细胞表面表达诸如CD46、CD55和CD59膜蛋白会抑制或减弱CDC作用。补体的激活是级联放大效应，靶细胞表达以上膜蛋白会在不同环节抑制补体的激活。

4)补体的来源：在血清中存在补体，加入实验体系后能够促进CDC作用。因此我们必须得清楚靶细胞是否与所选择的动物种属血清相匹配。一般来说，我们研究针对人的抗原生产抗体，得到的人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体均需是使用人的血清，兔的血清偶尔也会用到，但临床有意义的数据需使用人的血清。鼠源血清对细胞有毒害且没有CDC作用，因此体外功能实验中很少会用到小鼠血清。

5)抗体抗原结合方位抗体与抗原的结合方位及相邻抗体的排列方式会显著影响CDC的作用，针对B细胞抗原CD20上市的抗体药物有很多，但他们在CDC作用表现出极大的不同。部分抗体能激活补体，有很强的CDC作用;部分抗体不同激活补体。

四、补体血清的保存及解冻

需要长期保存的血清必须储存于- 80℃低温冰箱中，不建议存放在4℃冰箱。当要解冻进行实验时，将从低温冰箱中取出的血清放入4℃冰箱中过夜溶解，然后移入室温或者可以置于37℃水浴中。切勿直接将血清从-80℃进入37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

化冻后的血清可能呈现浑浊，主要是因为血清制备过程中会保留部分纤维蛋白原，化冻过程中纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，使血清中出现浑浊的絮状物。这种情况不影响血清的功效。如果其浑浊对后续实验有影响，以400g 稍微离心，将上清液加入培养基内一起过滤，也可直接过滤血清以去除这些絮状物。

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• Fc Biological Activity：ADCC/ADCP/CDC

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